Graphe de Michaelis-Menten:Vi en fonction de [S]

Il existe deux méthodes graphiques permettant d'interpréter les caractéristiques d'une réaction enzymatique à partir de l'équation de Michaelis-Menten.

La première est le graphique de Michaelis-Menten,il représente la vitesse initial(Vi) en fonction de la concentration de substrat([S]).

La courbe obtenu possède une asymptote horizontal représentant la vitesse maximal(Vmax),c'est à dire le moment où l'enzyme est saturée et où la vitesse de réaction est optimum.(ici Vmax = 5 u.a.). On sait que le Km représente la concentration de substrat pour laquelle Vi est égal à Vmax / 2 (ici Vmax / 2 = 2,5 u.a.). Il suffit ensuite de lire le graphique pour obtenir la valeur du Km(ici Km = 3 u.a.).

La seconde méthode est appelée graphique de Lineweaver-Burk, cette méthode donne une droite représentant l'inverse de la vitesse initial(1 / Vi) en fonction de l'inverse de la concentration de substrat (1 / [S]).

Cette droite à deux particularités:

-Son intersection avec l'axe vertical représente 1 / Vmax.

-Son intersection avec l'axe horizontal représente 1 / Km.

Il est de nos jours plus correct de réaliser par ordinateur le graphique de Michaelis- Menten car celui de Lineweaver-Burk donne beaucoup trop d'importance aux valeurs expérimentales les plus imprécises (ex: pour les plus petites concentration de substrat)? Cependant la représentation de Lineweaver-Burk est encore souvent utilisé car elle donne une impression immédiates des résultats

Afin de poursuivre notre démarche, nous allons donc réaliser une expérience dans le but de prouver et de déterminer le Km pour la catalase du tubercule de navet.

Protocole expérimental

Hypothèse : Prouver et déterminer le Km pour la catalase du tubercule de navet en évaluant la vitesse de la réaction en fonction de la concentration du substrat.

Matériels : _solution de catalase

                  _eau oxygéné à 0.1V, 0.25V, 0.5V, 0.75V

                  _logiciel EXAO

Protocole :

1)      Programmer l’ordinateur sur « oxymétrie » puis « paramètre » :

   _durée en min : 3

   _concentration min de O2 : 0

   _concentration max de O2 : 20

2)      Prélever 10 mL de solution de catalase et le verser dans l’enceinte du bioréacteur. Fermer l’enceinte.

3)      Mettre en route l’agitateur magnétique et tourner délicatement le bouton pour réduire la vitesse de l’agitateur, il ne doit pas tourner trop vite mais ne doit pas non plus s’arrêter.

4)      Préparer dans une petite seringue 0.5 mL d’eau oxygénée a 0.1V sans emprisonner d’aire. Mettre le cathéter qui est au bout de la seringue dans le petit trou du couvercle de l’enceinte mais ne pas injecter immédiatement le contenu.

5)      Cliquer sur « démarrer » pour obtenir l’enregistrement. Si la courbe qui apparaît n’est pas bien encadré, il faut utiliser les + ou – situer à gauche des graphes pour réduire l’échelle.

6)      Au bout de 30 sec, injecter dans l’enceinte les 0.5 mL d’eau oxygénée en prenant soin d’appuyer sur « repère » au moment de l’injection et attendre la fin de l’enregistrement.

7)      A la fin de la mesure, arrêter l’agitateur, vider l’enceinte sans déplacer ni abîmer la sonde, rincer.

8)      Réitérer l’opération pour chaque concentration d’eau oxygénée.